明代后期西方传教士的来华，是中国历史上基督教的第三次传华，在影响上远远超过了前两次，这一次的基督教传华，更加突出了中西方文化交流的内涵。明后期基督教传入中国的西方背景，是基督教内部的新旧教派之争与地理大发现后的海上扩张**时期。而当时中国的背景，则是宋明理学的一统地位发生动摇，各种学说兴起，传统社会开始向近世转化的时期。
第一个企图打开明朝封闭的大门进入中国的西方传教士是西班牙人方济各·沙勿略（Francis Xavier，1506—1552年），他是当时天主教耶稣会的首批成员之一。但是他只到达了靠近广东的上川岛，没有进入中国内地就在那里病故了。
就在沙勿略死后第二年，明嘉靖三十二年（1553），葡萄牙人行贿于明朝海道副使汪柏，借口遇到风暴，要求在澳门晾晒浸水货物，由此开始进入到澳门。当时正是倭寇经常侵扰福建、广东一带的时候，葡萄牙人通过帮助打击海盗取得了明朝廷的信任，嘉靖三十六年（1557）被允从上川岛移住澳门。于是耶稣会士也随之进入澳门，开始在当地的中国人当中传布天主教。
在起初的传教过程中，传教士们要求凡是入教的中国人，必须首先取葡萄牙文的名字，学会葡萄牙语，从生活上也必须葡萄牙化。这种传教方式，不符合当时中国的国情，因此几乎无法开展传教工作。耶稣会负责远东事务的意大利人范礼安（Alexan- dre Valignani，1538—1606年）认为只有按照中国的风俗进行传教，才有可能打开中国传教的大门。他的建议得到了耶稣会的批准，于是三名传教士从印度被调往了澳门。他们是巴范济（F.Passio）、罗明坚（M.Ruggieri）和利玛窦（Matthieu Ricci）。
罗明坚于万历七年（1579）夏天到达澳门，并开始学习汉语言，他利用语言的便利结交了明朝的当地官员，终于在万历十一年（1583）被获准在广东肇庆居住，并且修建了第一座天主教堂。
在最初的传教活动中，传教士们尽量去适应中国的习俗，他们甚至都穿上中国式的长袍。他们非常善于不露痕迹地宣传基督，将圣母和基督的画像放在教堂中，任凭来访的中国人跪拜。长期以来中国的多神崇拜，使人们并没有对西方的神像产生过多的怀疑。但是后来便发生了教堂与当地民众的冲突，不同文化的碰撞在这里体现出来。罗明坚在此后虽然受两广总督郭应聘之请到浙江杭州传教，但他的传教活动始终没有能够展开。万历十三年（1585），他返回欧洲后没有能够再回到中国，他在肇庆建立的第一座天主教堂也在六年后被关闭。但是罗明坚毕竟是明后期第一个在中国传教的西方传教士，他不仅印制了《祖传天主十诫》的宣传材料，并且是第一个用汉文撰写宣扬天主教教义著作的外国人，他在万历十二年（1584）撰写了《天主圣教实录》一书，他在书中用文言将天主教的一些名词作了注音及意译，对天主教的教义“用适合百姓水平的文体”进行了解释。所以后来人们一直都将他作为明代西方传教士在中国传教的开创者。
罗明坚以后，继承他在中国传教的主要传教士便是后来名声颇著的利玛窦。
利玛窦起初作为罗明坚的助手，罗明坚走后便成为了当时传教团的主要负责人。他同罗明坚一样非常重视在传教中去适应中国的文化传统，穿中式的衣服，讲汉语，并且研究儒家的经典，与明朝的士大夫们交往，这一切当然都是为传教服务的手段，但是这些手段确实起到了相当大的作用。利玛窦在肇庆时认识了一个名叫瞿太素的士大夫，后来利玛窦移居韶州后，瞿太素便成为了第一个皈依天主教的明朝上层社会人物，是他告诉利玛窦不要穿中国僧人的服装而着儒士服装的。关于瞿太素其人的具体情况，史书记述不详，《利玛窦中国札记》中说： “他是一个被称为尚书的第二级高官的儿子，苏州人，是受过良好教育的知识分子。他的父亲因有官职而知名，但更因他是三百名应博士学位考试中的魁元而著称。”这样的人物在当时只有死后被赐尚书的礼部左侍郎瞿景淳，《明史》中说景淳有两子：汝稷、汝说。但是当初为景淳作传的王世贞却明确记说他有三个儿子，瞿太素便应当是其中的一个。只是因为他后来交结败类，沾染恶习，有辱家门而不再被人提及了。
万历十八年（1590），利玛窦在韶州建立了第二座天主教堂。这次建立教堂与肇庆不同之处在于是它开始有了更多的信徒，据记到万历三十五年（1607）止，韶州的教徒已经超过八百人。
利玛窦建立的第三座教堂在南昌，这是一次计划外的举动。他本于万历二十三年（1595）随侍郎石星前往北京，后因石星改变主意而留在南京，南京官员又拒绝其住留，只得退居南昌，于是在南昌开辟了传教事业。
万历二十六年（1598）利玛窦从南昌再次前往北京未成，于次年在南京城西建立了第四座教堂。南京是明朝的留都，地位仅次于北京，南京教堂的建立，说明天主教开始进入了明朝的政治文化核心地区，并由此而引发了明朝高层参与的中西方文化冲突，即后来的“南京教案”。然而当时利玛窦对于在南京的活动并不感到满足，他一直将传教的目标指向北京。在《利玛窦中国札记》中曾经这样记述了他当时的心情：
他在睡眠中做了一个梦，梦见他遇到一个陌生的行人向他说：“你就这样在这个庞大的国家中游荡，而想象着你能把那古老的宗教连根拔掉并代之以一种新宗教吗？”原来，自从他进入中国时起，他始终是把他的最终打算当作绝密加以保守的。所以他答道：“你必定要么是魔鬼，要么是上帝自己，才知道我从未向人吐露的秘密。”他听到回答说：“根本不是魔鬼，倒是上帝。”看来好像他终于找到了他一直在寻找的人了，他跪在这个神秘人的足下，含泪请求他：“主啊，既然你知道我的想法，为什么不在这困难的事业中助我一臂之力？”说完这话，他趴在地上哭，泣不成声。到最后他听见保证的话时才感到一阵安慰：“我将要在两座皇城里向你启祥。”那和上帝曾在罗马答应帮助圣依纳爵的话，字数完全一样。他仍在梦里，恍惚进了皇城，完全自由而安全，没有人反对他的到来。
他之所以会有这样的梦境，实在是因为他太想在北京获得成功了。
万历二十八年（1600）年末到二十九年（1601）初，利玛窦通过太监马堂终于再次来到了北京，而且将礼品和奏章送到了神宗那里。那是一份无可挑剔的奏章，利玛窦在其中声称自己来华的原因是“逖闻天朝之声教文物，窃愿沾被余溉，终身为氓，始为不虚所生”。他称自己“颇知中国古先圣人之学，于经籍略能记诵，而通其旨”。“伏念堂堂天朝，且招徕四夷，遂奋志努力，径趋阙庭”。他带给神宗的礼物包括：天主像一幅、天主母像一幅、天主经一本、珍珠镶嵌十字架一座，报时钟二架、《万国图志》一册、西琴一张。尽管当时礼部尚书朱国祚两次上疏请求“乞量给所进行李（贡物）价值，照各贡译例，给与利玛窦冠带，速令回还，勿得潜住两京，与内监交往，以致别生枝节，且使眩惑愚民”。但是神宗都没有给予理睬，利玛窦被获准在北京传教，从此北京的传教士们成了宫中尤其是太监们的常客。
万历三十三年（1605），利玛窦在北京宣武门建立了教堂，这就是后来著名的“南堂”。这一年北京受洗的教徒超过了二百人，从人数上看虽然不算很多，但是因为是在京城，影响之大是可想而知的。万历三十七年（1609），在利玛窦等人的支持下一个取教名为路加的吏员出面成立起了中国第一个圣母会。几个月后的万历三十八年（1610）三月十八日，利玛窦病逝于北京。神宗特赐墓葬，墓地在北京阜城门外。利玛窦是继罗明坚以后传教最为成功的一个，是他通过晋见神宗皇帝从而打开了在中国传教的官方通道，所以他比起罗明坚等人有着更大的影响。按照明朝人的记述，当时来华的传教士除利玛窦外，还有意大利人龙华民、王丰肃、熊三拔、毕方济、艾如（儒）略，西班牙人庞迪我，葡萄牙人阳玛诺，瑞士人邓玉函，德意志人汤若望、罗雅谷（各），均见于《明史·意大利亚传》，韩霖、张赓《圣教信证》中还载：尚有意大利人罗明坚、杜奥定、卫匡国，葡萄牙人孟三德、罗如望、苏如汉、费奇规、傅汛济、费乐德、伏善望、瞿西满、郭纳爵、何大化、孟儒望、安文思，瑞士人郭居敬，拂览第亚人金尼各（阁），西济利亚人贾宜睦、潘国光等，并有著述，阐述教义，而纳袜辣人方济各·沙勿略，在嘉靖世，至我国边关即卒，实早于利玛窦来华三十年也。
明代西方传教士能够取得一定的成功，在于他们在传教思想上的两方面努力，一是他们将天主教中国化的努力，一是他们与中国儒学结合的努力。他们因此而取得了一批明朝社会上层士大夫的支持，其中最著名的是徐光启、李之藻和杨廷筠。而在南京的时候焦竑和李贽也都十分敬重利玛窦，并对其教义表示了赞赏。这与当对明朝士大夫自身的情况有直接关系。徐光启等人都是晚明实学的倡导者，他们不仅接受了天主教的教义，而且接受了传教士们带来的西方科技，焦、李更是泰州学派的传人，他们代表了晚明士大夫中思想解放的一类。当然，在当时的士大夫中间，更多的人对这种外来文化的东西是表示怀疑的，也有相当一批反对派，以沈?所发起的“南京教案”，则是一次典型的东、西方文化冲突。
天主教的教义，对于晚明禅化的儒学者来说，是很难接受的，他们认为天主教的传播是“欲扫灭中国圣贤传统”，因此是“邪教”。一些士大夫为此而撰写了声讨天主教的文章，如王朝式的《罪言》、李生光的《辟教辩证》、黄贞的《破邪集》等等。
万历三十八年（1610），传教士王丰肃在南京建起了西式教堂，引起一批官员士大夫的不满。四十三年（1615），沈?出任南京礼部侍郎后，便先后两次上疏明神宗，请求禁教，但是没有得到神宗的批准。四十四年（1616），他第三次上疏，得到内阁大学士方从哲的支持，遂将王丰肃逮捕，同时被捕的还有一些传教士和教徒。当时礼科给事中余懋孳的上疏中更将天主教与当时被严禁的白莲教等列为一处：
自利玛窦东来，而中国复有天主之教。乃留都王丰肃、阳玛诺等，煽惑群众不下万人，朔望朝拜动以千计。夫通番、左道并有禁。今公然夜聚晓散，一如白莲、无为诸教。且往来壕镜，与澳中诸番通谋，而所司不为遣斥，国家禁令安在。
其后虽然有禁教之令，而“命下久之，迁延不行，所司亦不为督发”。“丰肃寻变姓名，复入南京，行教如故，朝士莫能察也”。到天启元年，沈?被罢后，教禁也就停止了。现代学者普遍认为“南京教案”是一次“具有文化排外的性质”的典型东、西方文化之争。当时一些传教士传说沈?收受了南京佛教徒一万两银子的贿赂，因此发起这场教案。这虽然只是传说，但是佛教僧人参与排斥天主教的活动，在当时确实是相当明显的。
与南京相比，当时新兴起的城市上海的情形就截然不同。万历三十六年（1608）郭居静应徐光启之邀到上海传教时，两个月间受洗人数便达五十人，三十八年又有一百五十人受洗，到崇祯间，上海教徒已达一千多人。这也反应了晚明南北两京在文化政治上的保守，与江南城市的思想活跃。其实从明中后期王阳明等人讲学开始，江南地区思想活跃的情况就已经比较明显了，这也是晚明文化发展的一个特点。