然而，就在吴三桂开藩设府，坐镇云南，权力和声势都达到顶点的时候，他与清朝中央政府的矛盾却开始激化起来。就清朝政府而言，使用吴三桂攻打南明政权，是为了建立其对全国的统治。为此目的，历时十数年，始将各地南明政权逐一消灭。在全国平定之后，清政府亟需在政治上实现对新占领地区的统治，在军事上裁减军队以减轻财政上的压力。因此，早在占领云贵之初，便向这些地区派出了行政官吏，而后不久，又计划撤回和裁减满洲及绿营军队。清朝的这些措施，无疑是和当时整个社会都需要休养生息的要求相符合的。但是，由于十几年来吴三桂政治、军事势力的迅速增长，清朝的这些措施却触犯到吴三桂本人的利益。就吴三桂方面说来，在南明政权尚未消灭之前，他与清政府命运相连，必须拼死作战。但在云贵底定之后，他便作起了“世镇云南”的美梦，并处心积虑地要把云南变为自己的割据领地。在政治上，为了巩固自己的地位，对于辖下的各级官吏，他“选用自擅”，“各省员缺，时亦承制除授，谓之西选”。与此同时，他还以重金收买在京朝官及各省将吏，为自己效劳。在经济上，吴三桂除利用政治特权籍没“故明沐天波庄田七百顷为藩庄”之外，还大肆兼并土地，“勋庄棋布”，对人民进行残酷的剥削和压迫。与此同时，他还“垄盐井、金铜矿山之利”，官卖各种土特产品，放高利贷，并凭借其庞大的财富，豢养宾客，收买士人。在军事上，他招纳李自成、张献忠余部，编为忠勇五营、义勇五营，加紧训练。此外，吴三桂还纵容部下将吏为非作歹，鱼肉百姓，“杀人越货，毫无畏忌，讼牒、命盗两案，甲兵居其大半”。事实证明，吴三桂已经成为分裂割据势力的总代表。
对于吴三桂的这些活动，清朝洞若观火。因而在云贵平定之初，便着手裁抑吴三桂的权势。康熙二年（1663）即以云贵军事行动已经停止为理由，收缴了他的平西大将军印信，接着，又“截其用人题补之权，迁除悉归部选”。六年，又乘其疏辞总管云贵两省事务之机，下令两省督抚听命于中央。同时，还剥夺了他的司法特权，“平西藩下逃人，俱归有司审理，章京不得干预”。吴三桂则以“构衅苗蛮，借事用兵”，扩军索饷相报复。吴三桂和清朝中央政府之间的矛盾更加尖锐了。
康熙十二年春，镇守广东的平南王尚可喜疏请归老辽东，康熙皇帝遂乘势作出了令其移藩的决定。而后，又对镇守福建的靖南王耿精忠的撤藩要求也依例照准。在形势的逼迫下，吴三桂也假惺惺地上疏朝廷，请求撤藩，实则希冀朝廷慰留他。对于吴三桂的真实意图，康熙皇帝非常清楚。他认为，吴三桂和朝廷对立已久，“撤亦反，不撤亦反。不若及今先发，犹可制也”。于是力排众议，毅然决定允其撤藩，还派专使至滇，雷厉风行地经理撤藩事宜。
清朝同撤三藩的决定粉碎了吴三桂“世镇云南”的美梦。吴三桂气急败坏，暗中指令死党向撤藩使者请愿，要求停止撤藩，继而又拖延时日，与心腹将领密谋发动叛乱。他还指使其党羽以“九天紫府刘真人”的名义吹捧自己是“中国真主”，为反叛大造舆论。在经过一阵短暂的准备后，同年十一月底，吴三桂铤而走险，杀巡抚朱国治，自号“周王天下都招讨兵马大元帅”，令部下“蓄发，易衣冠”，称兵反叛于云南。为了给自己的反叛活动披上名正言顺的外衣，吴三桂在“矢忠新朝”三十年后，又扯起了“复明”的旗号。反叛之前，他装模作样地率领部下祭扫桂王陵墓，“恸哭，伏地不能起”，对部下大加煽动。反叛之后，又发布檄文，指责清朝“窃我先朝神器，变我中国冠裳”，并声称要“共举大明之文物，悉还中夏之乾坤”。一场大规模的叛乱活动就这样开始了。
由于吴三桂专制滇中十四年，这场叛乱又是蓄谋已久，因此，在反叛之初，吴军乘锐连下贵州、湖南，福建靖南、广东平南二藩和吴三桂在各地的党羽如四川之郑蛟麟、谭弘、吴之茂，广西之罗森、孙延龄，陕西之王辅臣，河北之蔡禄等也先后揭起叛旗，纷纷响应。一时之间，形势对吴三桂显得非常有利。在他看来，自己军队的战斗力远胜八旗，而揭起反满的旗帜，可以争取广大汉族士民的支持，就指挥才能而言，年轻的康熙皇帝又决非自己的对手。他以为自己又可以稳操胜券了。但是，实际情况恰与吴三桂的愿望相反。一是吴三桂兵力虽然强盛，但却不具战略眼光。在其起兵之后，既没有“疾行渡江，全师北向”，设法以军事上的胜利去推动政治上的成功；也没有“下金陵，扼长江，绝南北通道”或 “出巴蜀，据汉中，塞淆函自固”，以建立巩固的后方，而是分兵湖南、江西、湖北，逐地争夺一些战略价值不高的城镇。这就贻误了战机，给了清朝政府以从容布置反击的时间。其次，由于此时清兵入关已经三十年，民族矛盾早已下降为次要矛盾。吴三桂以反满相号召不过是刻舟求剑，脱离实际。而且，吴三桂降清以来的自我表演也太充分了。在民族矛盾最尖锐、民族斗争最激烈的时刻，他信誓旦旦地表示要“矢忠新朝”，对各地抗清义军极尽镇压之能事，曾几何时，他却又要“共举大明之文物”了。吴三桂的自我表演使人们看穿了他是一个见利忘义、口是心非、反覆无常的野心家，一些有气节的汉族知识分子对之更是嗤之以鼻，耻与为伍。因而吴三桂发出的“反清复明”的号召，在广大汉族士民中并未产生什么重要影响。
再有，与吴三桂的估计相反，康熙皇帝虽然年轻，但却有着杰出的政治才干。早在撤藩之初，便已对撤藩可能导致的后果有所准备，因此在他得知吴三桂反叛的消息后，镇定自若，措置得当。他首先停撤平南、靖南二藩，以在政治上孤立吴三桂，而后，又在京师处死吴三桂之子吴应熊及其同党，以打击吴三桂气焰，巩固后方。与此同时，为对吴三桂部下进行分化瓦解，康熙皇帝还宣布，在各省任职的吴三桂部下的亲属概不株连，各安职业。在军事上，康熙皇帝也作了周密的部署。他任命顺承郡王勒尔锦为宁南靖寇大将军，率师征讨吴三桂，还分别派出得力将领硕岱、赫业、马哈达、科尔坤等分赴荆州、兖州、太原、四川等军事重地。虽然在叛乱发动之初，清兵有所失利，但是，由于在政治上是讨逆平叛，经济上是以全国制一隅，时间不长，便扭转了军事上的失利局面，使得正面进攻的吴军，不能越长江一步，双方在战场上暂时出现了相持的局面。
康熙十五年是双方军事形势发生重要转折的一年。由于兵兴三年，吴三桂深感兵力、财力严重不足，而吴在各地的党羽也纷纷离心离德，各有图谋。与此相反，清朝政府却以全国的兵源、财源作后盾，数路出兵，进行反攻，并迫使各地之吴军处于守势。在湖广战线上，清军将领安亲王岳乐师出湖南，连克萍乡、醴陵、浏阳等重要城镇，矛头所向，直指省府长沙。在西北战场上，自是年初图海任统帅以来，所向皆捷。六月，穷蹙无路的王辅臣被迫投降。在东部战场上，康亲王杰书也率师自浙入闽，连克重镇。十月，耿精忠被迫投降，清师进入福州。受此影响，盘踞广西的孙延龄和盘踞广东的尚之信也表示要叛吴降清。十二月，孙延龄因事泄被杀，尚之信则遣使诣江西简亲王喇布军前投降。此后，在清军发起的不断进攻下，湖南、江西的吴军处境愈益恶化，吴军本部也开始出现了叛吴降清的现象。为了摆脱被动局面，康熙十七年（1678）三月，吴三桂撕下了“复明”的面纱，演出了一出称帝的丑剧，以衡州为“定天府”，建国号周，改元“昭武”，册妻张氏为后，孙吴世璠为太孙，置官封拜，颁制新历，举行云贵乡试。但是这些活动并没有给这个野心家带来什么好运，前线告急文书仍如雪片一样飞来。吴三桂气急败坏，称帝不久，便病倒在床，是年八月死于衡州，从而结束了这个身经两朝、历事三主的野心家的一生，时年六十七岁。
吴三桂死后，部下郭壮图、方光琛等拥立其孙吴世璠即位于贵阳，改元洪化。控制地盘越来越小，内部也更加分崩离析。乘此时机，清朝政府加强了政治策反和军事进攻。康熙十八年（1679），克复湖南、广西，十九年，又下四川、贵州并进兵云南，二十年春，师围云南省城昆明，并分兵克复附近州县。十月，昆明城内粮尽援绝，吴世璠自杀，余部投降。由吴三桂掀起的持续八年之久的一场大规模的内战至此全部平定。