1661年，19岁的牛顿以减费生的身份进入剑桥大学三一学院，靠为学院做杂务的收入支付学费，1664年成为奖学金获得者，1665年获学士学位。
17世纪中叶，剑桥大学的教育制度还渗透着浓厚的中世纪经院哲学的气味，当牛顿进入剑桥时，哪里还在传授一些经院式课程，如逻辑、古文、语法、古代史、神学等等。两年后三一学院出现了新气象，卢卡斯创设了一个独辟蹊径的讲座，规定讲授自然科学知识，如地理、物理、天文和数学课程。
讲座的第一任教授伊萨克？巴罗是个博学的科学家。这位学者独具慧眼，看出了牛顿具有深邃的观察力、敏锐的理解力。于是将自己的数学知识，包括计算曲线图形面积的方法，全部传授给牛顿，并把牛顿引向了近代自然科学的研究领域。
在这段学习过程中，牛顿掌握了算术、三角，读了开普勒的《光学》，笛卡尔的《几何学》和《哲学原理》，伽利略的《两大世界体系的对话》，胡克的《显微图集》，还有皇家学会的历史和早期的哲学学报等。
牛顿在巴罗门下的这段时间，是他学习的关键时期。巴罗比牛顿大12岁，精于数学和光学，他对牛顿的才华极为赞赏，认为牛顿的数学才超过自己。后来，牛顿在回忆时说道：“巴罗博士当时讲授关于运动学的课程，也许正是这些课程促使我去研究这方面的问题。”
当时，牛顿在数学上很大程度是依靠自学。他学习了欧几里得的《几何原本》、笛卡儿的《几何学》、沃利斯的《无穷算术》、巴罗的《数学讲义》及韦达等许多数学家的著作。其中，对牛顿具有决定性影响的要数笛卡儿的《几何学》和沃利斯的《无穷算术》，它们将牛顿迅速引导到当时数学最前沿～解析几何与微积分。1664年，牛顿被选为巴罗的助手，第二年，剑桥大学评议会通过了授予牛顿大学学士学位的决定。
1665～1666年严重的鼠疫席卷了伦敦，剑桥离伦敦不远，为恐波及，学校因此而停课，牛顿于1665年6月离校返乡。
由于牛顿在剑桥受到数学和自然科学的熏陶和培养，对探索自然现象产生浓厚的兴趣，家乡安静的环境又使得他的思想展翅飞翔。1665～1666年这段短暂的时光成为牛顿科学生涯中的黄金岁月，他在自然科学领域内思潮奔腾，才华迸发，思考前人从未思考过的问题，踏进了前人没有涉及的领域，创建了前所未有的惊人业绩。
1665年初，牛顿创立级数近似法，以及把任意幂的二项式化为一个级数的规则；同年11月，创立正流数法（微分）；次年1月，用三棱镜研究颜色理论；5 月，开始研究反流数法（积分）。这一年内，牛顿开始想到研究重力问题，并想把重力理论推广到月球的运动轨道上去。他还从开普勒定律中推导出使行星保持在它们的轨道上的力必定与它们到旋转中心的距离平方成反比。牛顿见苹果落地而悟出地球引力的传说，说的也是此时发生的轶事。
总之，在家乡居住的两年中，牛顿以比此后任何时候更为旺盛的精力从事科学创造，并关心自然哲学问题。他的三大成就：微积分、万有引力、光学分析的思想都是在这时孕育成形的。可以说此时的牛顿已经开始着手描绘他一生大多数科学创造的蓝图。
1667年复活节后不久，牛顿返回到剑桥大学，10月1日被选为三一学院的仲院侣（初级院委），翌年3月16日获得硕士学位，同时成为正院侣（高级院委）。1669年10月27日，巴罗为了提携牛顿而辞去了教授之职，26岁的牛顿晋升为数学教授，并担任卢卡斯讲座的教授。巴罗为牛顿的科学生涯打通了道路，如果没有牛顿的舅父和巴罗的帮助，牛顿这匹千里马可能就不会驰骋在科学的大道上。巴罗让贤，这在科学史上一直被传为佳话。